MVD\TSP-1在恶性血液病中的水平测定及意义

       【摘要】目的 探讨恶性血液病患者骨髓中微血管密度（MVD）和凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）的表达及意义。方法 选择恶性血液病患者40例（19例急性白血病AL、8例慢性粒细胞白血病CML、13例多发性骨髓瘤MM）为研究组，正常对照组20例，利用SP免疫组化法检测研究组治疗前后及对照组骨髓组织活检病理标本中MVD水平及TSP-1表达情况。结果 ①MVD在AL、CML、MM等不同疾病中的同一阶段，测定水平无显著性差异（P >0.05）；而在初诊组与未缓解组，MVD值高于对照组及缓解组（P <0.01）。②TSP-1在AL、CML、MM等不同疾病中的同一阶段，阳性表达无差异（P >0.05）；而在初诊组与未缓解组，TSP-1阳性率低于对照组及缓解组（P <0.05）。③在MVD高表达组，TSP-1阳性表达率为21.2%，而MVD低表达组，TSP-1的阳性表达率为70.8%，TSP-1和MVD之间具有负相关性。结论 ①MVD是了解病情、判定疗效的独立指标。②TSP-1是血管生成负性调节分子。③MVD与TSP-1两者呈负相关，联合检测MVD和 TSP-1有助于更准确的评价疾病状态及疗效，指导治疗。

　　恶性血液病是一组起源于造血系统的恶性克隆性疾病，包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等，根据流行病学统计，我国恶性血液病的发病率呈逐年递增趋势。所以，极有必要进一步探讨其发病机制，寻找评价疗效、判断预后的影响因素，以通过更多的指标和角度了解疾病状况，指导临床治疗。我们检测了40例恶性血液病（19例急性白血病AL、8例慢性粒细胞白血病CML、13例多发性骨髓瘤MM）患者治疗前后骨髓微血管密度（MVD）和凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）的水平，并与正常对照组MVD、TSP-1水平进行比较，结果如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　研究组：本院2006年1月～2009年12月期间住院的恶性血液病患者，诊断及疗效判定均按照张之南编写的《血液病诊断及疗效标准》[1]。其中AL19例，CML8例，MM13例，年龄18～ 72岁，男24例，女16例。分别于治疗前后采集骨髓组织活检标本。按照治疗情况分组：初诊组40例，缓解组27例，未缓解组13例。

　　对照组：同期采集正常对照组骨髓标本20例，包括白细胞减少症9例，免疫性疾病7例，Ⅰ、Ⅱ期淋巴瘤4例，年龄20～66岁，男11例，女9例。在年龄、性别方面与研究组具可比性。

　　1.2 方法

　　研究组分别于治疗前和治疗开始后4周采集骨髓组织标本。利用SP免疫组化法检测研究组和对照组MVD和TSP-1的表达。

　　1.3 结果判定

　　1.3.1 MVD的计算方法

　　每张石蜡切片先在10×10倍视野下选择出3个血管最多的区域（热点区），然后在10×40倍视野下计数每个热点区的微血管数，用3个热点区的均数来表示MVD，表达为：微血管数/10×40视野。凡染色呈阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇均计数为一个血管，管腔面积大于8个红细胞的血管不计数。

　　1.3.2 TSP-1的阳性判定

　　细胞胞浆及细胞外基质呈现棕黄色染色，明显高于背景者为阳性细胞。先在10×10倍视野下筛选出3个TSP-1 表达最强的区域，然后在10×40倍视野下，按显色强度（未着色，弱，中，强分别积分为0 ，1，2 ，3 分）和阳性细胞百分数（0，1 %～25 % ，26 %～50 % ， >50 %者分别积分为0 ，1，2 ，3 分），两项数值之和平均为0～2分者为TSP-1阴性，3～6分者为TSP-1阳性。　　1.4 统计学分析

　　MVD为数值变量资料，采用均数±标准差表示，不同研究组间两两比较、不同疾病间两两比较均采用t检验；TSP-1为定性变量资料，用百分数表示，在不同组间及不同疾病间的表达用χ2检验或Fisher确切概率法。统计结果均采用双侧检验，P< 0. 05认为差异有统计学意义。统计学分析用SPSS13. 0统计软件包。

　　2 结果

　　2.1 MVD的表达及比较：

　　2.1.1 MVD在不同疾病间的比较

　　通过对共100例标本的骨髓MVD水平检测显示，在AL、CML、MM组患者，初诊时MVD水平分别为（28.5±5.0）、（30.6±4.6）、（32.1±6.0）（单位：/10×40视野，下略），治疗缓解后MVD水平分别为（11.8±4.1）、（13.3±4.6）、（12.9±3.9），而未缓解的AL、CML、MM患者，MVD分别为（25.6±5.4）、（29.3±4.6）、（27.9±5.3），正常对照组MVD（10.8±5.9）。结果见表1。

　　注：*间两两比较、#间两两比较、⊿间两两比较，均为P＞0.05，差异无显著性；*与对照组、⊿与对照组比较，P＜0.01，存在显著性差异；#与对照组比较，P＞0.05，无显著性差异。

　　所以，恶性血液病患者，无论AL、CML、MM，在疾病同一阶段中MVD的测定值无显著性差异，说明骨髓MVD与上述恶性血液病种类无关。而且，通过对比骨髓MVD在急性白血病不同亚型中的水平（结果见表2），可以看出，MVD在白血病各亚型间的表达无显著性差异。

　　2.1.2 MVD在疾病不同阶段的比较

　　由表1进一步分析，若按照治疗情况分，在初诊组、缓解组、未缓解组、对照组的MVD水平分别为（30.1±5.4）、（12.5±4.1）、（27.1±5.0）、（10.8±5.9），其中缓解组与对照组比较、初诊组与未缓解组比较，差异均无显著性（P＞0.05）；而初诊组MVD水平明显高于缓解组与对照组，差异有显著意义（P＜0.01）；未缓解组MVD水平亦高于缓解组与对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。从形态方面看，对照组和缓解组的骨髓微血管比较直，形状规则，大多有管腔形成，而初诊组和未缓解组的骨髓微血管迂曲，排列杂乱无序，管腔很小，甚至无管腔。见图1、2。

　　2.2 TSP-1的阳性表达及比较

　　2.2.1 TSP-1在不同种类疾病间的比较

　　通过对所有骨髓标本的TSP-1水平检测显示，在AL、CML、MM组患者，初诊时TSP-1阳性率分别为26.3%、12.5%、15.4%，治疗缓解后的TSP-1阳性率分别为69.2%、80.0%、66.7%，而未缓解的AL、CML、MM患者，TSP-1阳性率分别为33.3%、33.3%、25.0%，正常对照组TSP-1阳性率70.0%。结果见表3。

　　注：*间两两比较、#间两两比较、⊿间两两比较，均为P＞0.05，差异无显著性；*与对照组、⊿与对照组比较，P＜0.05，存在显著性差异；#与对照组比较，P＞0.05，无显著性差异。

　　通过分析TSP-1在急性白血病不同亚型中的阳性分布情况（结果见表4），可以看出，TSP-1在急性白血病各亚型间的阳性表达一致。

　　所以，恶性血液病患者，无论AL、CML、MM，在疾病同一阶段中TSP-1的阳性表达率无显著性差异，TSP-1的阳性表达与上述恶性血液病种类无关。TSP-1的表达情况见图3、4。

　　2.2.2 TSP-1在疾病不同阶段的阳性表达

　　由表3进一步分析，按照治疗情况分，TSP-1的阳性率在初诊组、缓解组、未缓解组、对照组分别为20.0%、70.4%、30.8%、70.0%，其中缓解组与对照组比较、初诊组与未缓解组比较，差异均无显著性（P＞0.05）；而初诊组TSP-1的阳性率明显低于缓解组与对照组，差异有显著意义（P＜0.05）；未缓解组TSP-1的阳性率亦低于缓解组与对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在上述数据中，缓解组的TSP-1阳性率甚至超过正常对照组，考虑与CML缓解组病例数相对较少有关，还有待于更多的病例进一步实验校正。

　　2.3 MVD、TSP-1与其他临床因素的相关性

　　将恶性血液病初诊患者以年龄、性别、外周血白细胞总数、血红蛋白、血小板水平作为分类因素进行分析MVD水平，将所有经治疗达缓解状态的患者与对照组以上述分类因素分析TSP-1阳性表达率，结果证明MVD、TSP-1与上述因素均无相关性。

　　2.4 MVD与TSP-1相关性分析

　　在检测的所有标本中，初诊和未缓解患者，MVD较高表达， TSP-1阳性率低下，而在治疗缓解者和对照组，MVD水平较低，TSP-1阳性率较高。在TSP-1阴性标本中，MVD水平为（25.1±9.7），在TSP-1弱阳性表达的标本中，MVD测定值为（17.0±7.7），而TSP-1强阳性组，MVD为（15.6±7.7），经统计学处理：MVD与TSP-1呈负相关。其相关性见表6。

　　3 讨论

　　近年来，微血管新生在各种恶性血液系统疾病发生发展中的作用日益受到重视，目前血管生成抑制剂沙利度胺、雷利度胺等已被广泛应用于临床治疗多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等疾病，并取得了确切疗效。

　　本研究检测了40例恶性血液病患者治疗前后骨髓MVD及TSP-1的表达，通过与对照组比较，以及治疗前后变化的分析，结果表明：AL、CML、MM患者在发病初期，骨髓MVD显著升高、TSP-1阳性率降低，治疗缓解后，MVD降低，TSP-1阳性率升高，接近正常人群水平；未缓解者MVD明显高于缓解者，而TSP-1阳性率低于缓解者。研究同时显示，骨髓MVD、TSP-1表达与恶性血液病种类无关，并且，与患者年龄、性别、外周血白细胞总数、血红蛋白、血小板等多种临床参数均无相关性，故可以作为独立的临床观察指标，上述结果进一步证明，微血管新生这一机制与恶性血液病的发生发展密切相关，微血管生成增加是疾病发生的基本病理过程，这与王敏等[2]对32例白血病患者的研究结果一致，故MVD可作为判定疾病状况、评价疗效的指标之一。

　　TSP-1是一种重要的细胞外基质糖蛋白，可由成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞和单核细胞等多种细胞分泌，能够影响及调控内皮细胞的粘附、运动和增殖[3]，有关TSP-1在肿瘤新生血管生成方面发挥促进作用还是抑制作用尚存在争议，Kasper等[4]报道在胰腺癌中TSP-1的表达与MVD呈正相关，TSP-1可以促进血管新生及肿瘤生长；但Rice[5]、Miyanaga[6]等报道在乳腺癌、直肠癌中TSP-1的表达与肿瘤组织中MVD的表达呈显著负相关，TSP-1可以降低细胞的粘附，诱导凋亡，抑制血管新生。上述研究表明TSP-1的作用存在组织特异性，可能依据组织、器官的不同而不同。Dawson等[7]认为这与TSP-1存在的两种受体——CD36、CD47的活性总和有关，TSP-1作用于不同的细胞型上不同的受体从而引发出不同的生物学效应。本试验表明在恶性血液病患者发病初期，TSP-1阳性率低下，治疗缓解后，TSP-1阳性率明显升高，提示在血液系统疾病中，TSP-1可能主要与骨髓中CD36受体结合，是抑制微血管新生、抑制恶性血液病发生发展的重要因子。

　　此外，通过对MVD和TSP-1两因素的对比分析，证明TSP-1和MVD之间具有显著负相关性，TSP-1可以抑制肿瘤血管的生成。联合检测MVD、TSP-1的水平对于反映疾病状况、判定疗效具有重要意义，并为临床医生制定下一步的治疗措施提供了参考依据，尤其对于治疗风险较大的恶性血液病，更要求治疗措施个体化，避免过度治疗和治疗不足情况的发生。而测定MVD、TSP-1水平，是否与患者生存期有关、是否可以早于形态学提示复发倾向，尚有待于进一步的病例研究和随访。
 

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